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技術(shù)文章

使用凍存管凍存和復(fù)蘇細(xì)胞怎么做

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  凍存管的使用是一門學(xué)問(wèn),并不是打開(kāi)液氮罐、放入凍存管、關(guān)上液氮罐這樣簡(jiǎn)單的三部曲可以完成的??茖W(xué)正確地使用凍存管,可以避免樣本的損失,并保護(hù)試驗(yàn)人員的安全。
  01細(xì)胞凍存流程
  1、用預(yù)熱過(guò)的 PBS 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行沖洗,棄去 PBS 后,加入含 EDTA 的胰酶消化液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化(消化液薄薄地覆蓋細(xì)胞表面即可,消化液濃度須根據(jù)不同的細(xì)胞系進(jìn)行調(diào)整)。
  2、37℃消化細(xì)胞 3–5 分鐘,不可過(guò)度消化。
  3、一旦細(xì)胞從底部脫離,即可用含血清培養(yǎng)基終止消化,并用吸管輕輕吹打以重懸細(xì)胞。
  4、離心(500 × g, 5 min)細(xì)胞重懸液以沉淀細(xì)胞,棄上清,用含血清培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞沉淀進(jìn)行重懸。
  5、對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)(推薦 Neubauer chamber)。
  6、離心(500 × g, 5 min)細(xì)胞重懸液,棄上清。用適當(dāng)體積含血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。
  7、將細(xì)胞重懸液以 1:1 比例與凍存液(60% 培養(yǎng)基,20% FCS,20% DMSO) 進(jìn)行混合后轉(zhuǎn)移至 Cryo.sTM 凍存管中。凍存管中細(xì)胞的濃度應(yīng)為 1–5 ×10^6細(xì)胞/ml。
  8、含有細(xì)胞的凍存管須按照 −1 K/min 的冷卻速率進(jìn)行冷凍。將凍存管插在含異丙醇的凍存盒小室并放置在−70℃的冰箱中可以實(shí)現(xiàn)上述要求。如果 凍存液中含有其他類型的樣品時(shí),則需要將 Cryo.s 凍存管在−20℃,−70℃或者液氮的氣相層進(jìn)行直接凍存。為確保每個(gè)樣品的均一凍存效 果,4 ml 和 5 ml 的 Cryo.s凍存管需在−20℃過(guò)夜凍存后再轉(zhuǎn)移至 70℃或者液氮的氣相層。
  9、然后將 Cryo.s 凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐。為避免污染(例如支原體)并考慮到安全預(yù)防規(guī)范的要求,建議將 Cryo.s 凍存管放置在液氮上方的氣相層而非液氮層。
  02細(xì)胞復(fù)蘇流程
  1、從液氮罐中取出凍存管后立即將其置于 37℃水浴中進(jìn)行解凍,解凍時(shí)間約 1–2min,解凍時(shí)需要不停搖動(dòng)凍存管令其盡快融化。此步解凍過(guò)程越快越好。
  2、將解凍好的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到 15 ml 離心管,并立即添加一定量含血清培養(yǎng)基進(jìn)行混合。
  3、離心(500 × g, 5 min)細(xì)胞重懸液,棄去上清。用適當(dāng)體積的含血清培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞沉淀進(jìn)行重懸后分裝到 1 個(gè)或多個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。
  4、請(qǐng)遵循細(xì)胞接種時(shí)的推薦濃度進(jìn)行培養(yǎng)。
  5、接下來(lái)的 12 個(gè)小時(shí)細(xì)胞需要靜置培養(yǎng)。
  6、細(xì)胞換液可在 24–48h 后進(jìn)行。

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